07月19 【成功案例】比較轉(zhuǎn)錄組分析和形態(tài)學(xué)對(duì)杏品種（Prunus armeniaca L.）的內(nèi)果皮發(fā)育缺陷的研究
研究背景：
杏（P.armeniaca）屬于薔薇科中常見(jiàn)的一種核果，全世界范圍內(nèi)分布廣泛，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含膳食纖維、有機(jī)酸、維生素C、胡蘿卜素、微量元素等。 木質(zhì)化的內(nèi)果皮（endocarp）在包括杏在內(nèi)的許多具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的核果（drupe fruits）種子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，為種子提供了安全的發(fā)育環(huán)境，避免了直接暴露于各類害蟲(chóng)與病原菌。 內(nèi)果皮木質(zhì)化是核果成熟的一個(gè)重要標(biāo)志，木質(zhì)化的過(guò)程本質(zhì)上是植物次生細(xì)胞壁形成與木質(zhì)素積累的過(guò)程，在以往其他核果中的研究發(fā)現(xiàn)，一些與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，比如MYB、NAC、MADs-box，在核果內(nèi)果皮的發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。 本研究以兩種不同內(nèi)果皮表型的兩種杏作為實(shí)驗(yàn)材料，借助高通量測(cè)序來(lái)揭示杏內(nèi)果皮發(fā)育背后的分子調(diào)控機(jī)制。
材料與方法：
測(cè)序材料：
LE品種杏 內(nèi)果皮薄、柔軟、韌性高 JG品種杏 內(nèi)果皮厚、堅(jiān)硬、韌性低 取樣部位： 去核果實(shí) 測(cè)序平臺(tái)： Illumina HiSeq? 2500 PE125測(cè)序
技術(shù)路線：
結(jié)果–LE、JG品種杏內(nèi)果皮表型觀察比較
a）如圖2所示，兩種品種杏的果實(shí)具有相似的發(fā)育模式，a1、b1、c1是以開(kāi)花后時(shí)間（DAFB)為橫坐標(biāo)，分別以果實(shí)重量、果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度為縱坐標(biāo)做圖，兩種杏的果實(shí)均呈現(xiàn)出了“雙S曲線”生長(zhǎng)模式，圖a2、b2、c2是分別對(duì)a1、b1、c1一階導(dǎo)數(shù)作圖，兩種果實(shí)同樣也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。 根據(jù)生長(zhǎng)曲線，研究者將果實(shí)的發(fā)育劃分為4個(gè)時(shí)期：第一次指數(shù)生長(zhǎng)期（before 30DAFB）、緩慢生長(zhǎng)期（30-49DAFB）、第二次指數(shù)生長(zhǎng)期（49-83DAFB）、成熟期（after 83DAFB）。
b）圖3展示了兩種品種杏的內(nèi)果皮在果實(shí)發(fā)育的不同階段各項(xiàng)指標(biāo)的比較，包括內(nèi)果皮木質(zhì)素含量（圖3d）、內(nèi)果皮厚度（圖3e）、內(nèi)果皮界面面積（圖3c）、內(nèi)果皮木質(zhì)素積累直觀觀察（圖3b）、內(nèi)果皮顯微鏡直觀觀察結(jié)果（圖3a）。 圖3a顯示，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮在15DAFB之前形態(tài)上基本無(wú)差異，15DAFB之后，LE品種的內(nèi)果皮開(kāi)始出現(xiàn)破裂缺失，隨著發(fā)育階段往后推移，破裂程度越來(lái)越大。 圖3e顯示，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮在30DAFB之前厚度上并無(wú)差異，之后在厚度上，兩種品種出現(xiàn)顯著差異。 圖3d顯示，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮中木質(zhì)素含量也在24DAFB之后出現(xiàn)顯著差異。
綜合以上表型觀察結(jié)果得出，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮發(fā)育過(guò)程以及內(nèi)果皮木質(zhì)素含量存在顯著差異。
結(jié)果–mRNA測(cè)序與轉(zhuǎn)錄本組裝
a）測(cè)序取樣部位 ： 去核后的果實(shí)，每個(gè)品種兩個(gè)生物學(xué)重復(fù) 測(cè)序取樣時(shí)間點(diǎn) ： 根據(jù)上一部分的表型觀察結(jié)果，LE品種內(nèi)果核在15DAFB時(shí)出現(xiàn)裂縫，在24DAFB時(shí)，裂縫程度開(kāi)始快速增大，因此，該mRNA測(cè)序項(xiàng)目選擇了15DAFB和24DAFB兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本 b）轉(zhuǎn)錄本組裝：測(cè)序共得到~20Gbase clean data，使用Trinity軟件組裝得到63,170條unigene，unigene N50大小1689bp，詳細(xì)組裝結(jié)果參見(jiàn)表1。
結(jié)果–unigene功能注釋
a）基于blast比對(duì)，63,170條unigene中有25,356可比對(duì)到日本杏（Japanese apricot）與桃（peach）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。 b）使用BLASTx（e-value閾值設(shè)為10e-5）將上述25,356條unigene比對(duì)到NR, Swiss-Port, GO, COG, KOG ，kegg數(shù)據(jù)庫(kù)以進(jìn)行功能注釋，每條unigene均有多條注釋，詳細(xì)的注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)信息請(qǐng)參見(jiàn)表3. c）GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋過(guò)程中，16,506條unigene被注釋到，其中， ‘metabolic process’ (8408 genes, 50.93%)是被注釋到最多的GO 條目；KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋過(guò)程中，4830條unigene被注釋到了118個(gè)代謝通路。大部分的unigene被注釋到了‘carbohydrate metabolism’ (905 genes), ‘translation’ (596 genes), ‘a(chǎn)mino acid metabolism’ (581 genes), or ‘folding, sorting and degradation’ (471 genes)等代謝通路。
結(jié)果–差異表達(dá)基因檢測(cè)
使用DESeq進(jìn)行了差異表達(dá)基因檢測(cè)，差異表達(dá)基因篩選閾值為：FDR<0.01，F(xiàn)C > 2 。15DAFB時(shí)間點(diǎn)上，兩個(gè)品種間檢測(cè)到差異表達(dá)基因2887個(gè)，24DAFB時(shí)間點(diǎn)上，兩個(gè)品種間檢測(cè)到差異表達(dá)基因886個(gè)，具體上下調(diào)、共有特有情況請(qǐng)參見(jiàn)圖5.
結(jié)果–差異表達(dá)基因功能分析
a）LE品種內(nèi)果皮破裂與發(fā)育不全是一個(gè)非常復(fù)雜的表型，與眾多的代謝通路相關(guān)，但類苯基丙烷相關(guān)通路是眾多代謝通路中已經(jīng)證實(shí)的非常重要的一個(gè)。該項(xiàng)目中對(duì)兩個(gè)品種在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因的KEGG富集分析結(jié)果也證實(shí)了上述事實(shí)，所以差異基因顯著富集于類苯基丙烷代謝、合成等通路。類苯基丙烷相關(guān)通路相關(guān)差異表達(dá)基因見(jiàn)列表4與圖6。
b）一些轉(zhuǎn)錄因子也被報(bào)道與內(nèi)果皮發(fā)育相關(guān)，包括SHP 、 STK、ALC、IND、FUL、RPL、NST1、NST3以及一些MYB家族轉(zhuǎn)錄因子。該項(xiàng)目中，SHP, FUL, MYB32 ,STK, MYB46–1, MYB46–2, ?NST1 也包含在兩個(gè)品種間的差異表達(dá)基因列表中，也發(fā)現(xiàn)了上述部分基因差異表達(dá)方向與預(yù)期不符。
結(jié)果–RT-PCR驗(yàn)證
挑取18個(gè)表型相關(guān)基因，對(duì)測(cè)序分析得到的差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，兩種技術(shù)得到的基因定量結(jié)果間的pearson相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.9188, P value 小于 0.0001，說(shuō)明測(cè)序分析結(jié)果具有較高的可靠性，RT-PCR定量結(jié)果參見(jiàn)圖8。
結(jié)果–共表達(dá)分析
a）文章最后，使用K-means聚類對(duì)之前得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行了共表達(dá)分析，分析結(jié)果顯示：基于表達(dá)趨勢(shì)，所有差異基因可劃分為7個(gè)cluster，每個(gè)cluster內(nèi)部的基因具有相似的表達(dá)趨勢(shì)，也就可能在細(xì)胞內(nèi)行駛著相似的功能，聚類結(jié)果見(jiàn)圖7。 b）之前分析得到的內(nèi)果皮發(fā)育相關(guān)基因大多分布在cluster1或者cluster6，cluster1中的基因在LE品種中高表達(dá)，JG品種低表達(dá)，cluster6與cluster1相反。
結(jié)論：
1）LE品種杏的內(nèi)果皮裂縫出現(xiàn)于15 DAFB（開(kāi)花后15天），裂縫面積也會(huì)在之后會(huì)越來(lái)越大；
2）成熟的LE品種杏的內(nèi)果皮的厚度及木質(zhì)素含量分別僅為內(nèi)果皮正常發(fā)育品種JG的60.39%、63.25%；
3）已有研究表明與內(nèi)果皮發(fā)育相關(guān)的一些轉(zhuǎn)錄因子及類苯基丙烷合成代謝相關(guān)基因，也包含于該項(xiàng)目得到的差異表達(dá)基因列表中；
4）一些轉(zhuǎn)錄因子尤其是NST1可能參與調(diào)控了類苯基丙烷相關(guān)代謝通路；